Preparamos a biblioteca de RNA-seq, com várias opções, como ribodepletion (bacteriana e eucariótica), enriquecimento poli-A, bibliotecas 3'-Tag-Seq (QuantSeq) Todas as bibliotecas são construídas para recuperar o transcrito completo, exceto para QuantSeq (sequenciação de extremidade 3'). Para single cell RNA-Seq , consulte a secção single cell.

A sequenciação é realizada Single End (SE) 100bp, SE 200 (100+100) e SE300 (150+150). O SE50 está disponível sob consulta.

Os protocolos SMART-SEQ2 que temos disponíveis permitem produzir bibliotecas de RNA-Seq a partir de quantidades muito limitadas de material inicial (5ng de RNA total de alta qualidade até células individuais). As leituras cobrem completamente o transcripto e podem ser usadas para detectar splicing alternativo, além da expressão diferencial.

Características principais:

• Quantidades RNA total baixas (por exemplo, de FACS).
• Construção de biblioteca de baixo custo com protocolo Nextera.

Requisitos:

• 0,5 a 5 ng de RNA total de alta qualidade ou 1-300 células individuais em tampão RLT+ (consulte para detalhes). Não realizamos isolamentos de RNA no laboratório.

Baseado na implementação de um protocolo Nextera para volumes pequenos que usam a transposase Tn5 para construção de bibliotecas.

Características principais:

• Pequenos volumes e baixo custo.

• Pode também ser usado para sequenciar plasmídeos ou amplicons (por exemplo, multiplas regiões genómicas de interesse amplificadas por PCR).

• Sequenciação em NextSeq2000 (por exemplo, 2x150bp PE) ou MiSeq (por exemplo, 2x250bp PE).

Requisitos:

• 1 ng de DNA genómico de alta qualidade ou amplicon(s) > 400bp.

A sequenciação por nanopore é conseguida com os sistemas Oxford Nanopore Technologies (ONT) e permite o sequenciamento de leitura longas a partir de amostras de DNA e RNA. Oferecemos a preparação e sequenciação de bibliotecas em MinION (PromethION P2 em breve), com “flow cells” MinION ou Flongle.

Características principais:

• Leituras longas

• Protocolos rápidos de preparação disponíveis

• Análise de sequenciação em tempo real.

• Adaptável à sequenciação directa de DNA ou RNA.

Requisitos:

• DNA genómico puro de alta qualidade (gDNA).

• Pureza medida usando Nanodrop – OD 260/280 ~ 1,8 e OD 260/230 ~ 2,0–2,2.

• Quantidade mínima, medida por Qubit – 1 µg.

Oferecemos o serviço 10X Genomics Visium Spatial Transcriptomics em parceria com a Histopathology Unit. Esta técnica permite o mapeamento da expressão de em seções de tecido, juntamente com coloração de H&E ou IF. Existem as opções FFPE (somente humanos e ratinhos) ou “fresh-frozen”. Uma atualização da técnica Visium HD, prometendo resolução ao nível de single-cell, será lançada nos próximos meses. Contacte a unidade para mais informações.

Sequenciação de rRNA 16S V4

Este protocolo metagenómico visa a região V4 da região 16S bacteriana (primers 515F-806R) servindo para amplificar a mesma região em bactérias e archaea (Walters et al., 2016). Usando uma abordagem de 280 multiplex e 2x250bp PE MiSeq, entregamos aproximadamente  50.000 leituras por amostra. Outras combinações de primers sob consulta (por exemplo, V4-V5).

Características principais:

• 3 PCRs independentes por amostra.

• Multiplex de alta capacidade para reduzir o custo por amostra.

Requisitos:

• 10 ul de cada amostra com concentração até 100 ng/ul.

• Para entrega de mais de 20 amostras, recomendamos o uso de placas de PCR (96 poços, fundo não plano) em vez de tubos. Orientação da amostra A1->A12.

• Para amostras de baixa biomassa (≺ 10ng/ul), entre em contato connosco.

Serviço expresso (V3-V4) e ou ITS (96 amostras).

Contacte a unidade para mais informações.

Oferecemos duas possibilidades: 10x Genomics scRNA-Seq e Flash-seq (a ser implementado)

10x Genomics é a tecnologia mais utilizada para a análise de grandes números de células. A plataforma permite análises de alto débito de vários tipos de células, bem como núcleos de célula. O protocolo baseia-se no encapsulamente células ou núcleos juntamente com esferas de gel em nanogotículas. Diferentes protocolos estão disponíveis: Gene Expression (GEX), scATAC, GEX+ “imune profiling” e multioma (GEX + ATAC). A análise preliminar de dados de célula única é fornecida pelos softwares Cell Ranger e Loupe Cell Browser.

Possibilidades:

• O recurso Barcoding pode ser útil para detectar certas proteínas na superfície da célula (CITE-seq) ou usar marcadores para agrupar diferentes amostras num canal (Cell Multiplexing/Cell Hashing). O plexing também pode ser obtido usando marcadores moleculares.

Contacte a unidade para mais informações.

Projeto Single Cell Hub 

O serviço de QC de ácidos nucleicos é baseado em 2 equipamentos: Fragment analyser e TapeStation, ambos da Agilent. O Fragment analyser é mais adequado para um grande número de amostras e a TapeStation para aquisição rápida e pequeno número de amostras ~ 7-8. O Fragment analyser s é mais sensível para baixas quantidades de RNA/DNA, enquanto o TapeStation permite discriminar a qualidade da amostra em RIM (RNA) ou DIM (DNA).

DNA - High Sensitivity NGS
DNA Fragment Concentration Range: 5 pg/uL - 500 pg/uL; DNA Smear Concentration Range: 50 pg/uL - 5000 pg/uL

RNA - High Sensitivity RNA
Quantitative Range (per smear) (Total RNA) 50 pg/uL - 5000 pg/uL; (mRNA) 500 pg/uL - 5000 pg/uL

TapeStation:

DNA - D1000: DNA Sizing Range: 35 bp - 1000 bp
Sample Concentration: 0.1 ng/µL - 50 ng/µL input DNA

DNA - D5000: DNA Sizing Range: 100 bp - 5000 bp
Sample Concentration: 0.1 ng/µL - 50 ng/µL input DNA

DNA - Genomic: Sizing Range: 200 bp - 60000 bp
Sample Concentration: 10 ng/µL - 100 ng/µL input DNA

RNA - High Sensitivity: Sizing Range: 100 bp - 6000 bp
Sample Concentration: 0.5 ng/µL - 10 ng/µL input RNA